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如何将双荧光素酶报告系统效率提高

发布日期: 2020-06-16
浏览人气: 954
   双荧光素酶报告系统通常以萤火虫萤光素酶为报告基因,以海肾萤光素酶为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势,广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。
  1、报告基因检测受多种因素影响(载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等),因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔。
  2.细胞培养时间不宜过长,12-36h内好;长时间培养后,细胞难裂解
  3.双荧光素酶报告基因的载体选择:
  a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体;
  b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子(如SV40、CMV),而选用中等强度的启动子(如TK)
  4.双荧光素酶报告基因的载体比例:根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整(萤火虫载体与海肾载体比例分别用1:10、1:20、1:50、1:100),萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。
  5.反应温度:室温(20-22℃)。各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温。
  6.双荧光素酶反应体积:20ul(细胞裂解产物)-100ul(萤火虫荧光素酶底物)-100ul(海肾荧光素酶底物),底物量可根据实际情况调整,但一定要保证底物过量,不然会造成检测结果出现大的偏差。
  7.细胞裂解产物存放:常温不超过6小时;-20℃一个月;-80℃半年。
  8.裂解产物与底物混合(手动加样):要求混合快速、混合时间一致,避免荧光素酶衰变的影响。
  9.发光半衰期:
  a)单荧光素酶检测,萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min
  b)双荧光素酶检测,萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min,海肾荧光素酶的发光半衰期约2min
  10.检测结果
  样品检测发光值应该远大于仪器背景值,例如10000。如果样品发光值。
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