磷酸化蛋白检测试剂盒的使用离不开离心管法

        磷酸化蛋白检测试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取磷酸化蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的*配方能够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。

　　一、试剂准备

　　1.1配制适当体积的2.0mol/LNaOH、4.7mol/LHCl和50mmol/LTris-HClBuffer（pH7.5）溶液。

　　1.2按照以下公式计算所需的检测液总体积。

　　检测液总体积=（标准曲线测定点数+样品数+空白数）×重复次数×每个样品所需的检测液体积

　　1.3根据所需的检测液总体积，取1体积试剂A和3体积试剂B，充分混匀，制成检测液。

　　1.4取7支1.5mL离心管，按照下表平行操作。

　　管号

　　所加溶液0123456

　　0.05MTris-HClBuffer（?L）500495490480470460450

　　磷酸化标准蛋白溶液（?L）

　　磷酸化标准蛋白终浓度（?g/ml）01020406080100

　　二、离心管法

　　2.1制作标准曲线

　　2.1.1取7支1.5mL离心管，各管分别加入200?L各浓度的磷酸化标准蛋白溶液。

　　2.1.2各管加入200?L2.0mol/LNaOH，混匀。

　　2.1.365℃水浴，保温30min。

　　2.1.4待溶液冷却至室温后，各管加入200?L4.7mol/LHCl，混匀。

　　2.1.5各管加入200?L检测液，混匀。

　　2.1.6室温静置30min，期间混匀1-2次，进行吸光度值检测前再混匀1次。

　　2.1.7以0号管作为空白对照，在分光光度计上测各管的A620值。

　　2.1.8重复步骤2.1.1-2.1.7，并计算出编号相同的两管中磷酸化标准蛋白浓度的A620值的平均值。

　　2.1.9以各管A620平均值为纵坐标，对应的磷酸化标准蛋白终浓度为横坐标，在坐标纸上或MicrosoftExcel软件中绘制标准曲线。

　　2.2未知样品蛋白质浓度测定

　　2.2.1将待测样品做适当倍数的稀释或浓缩。

　　2.2.2取3支1.5mL离心管，其中一管加入200?L0.05M的Tris-HClBuffer作为空白对照，其余两管分别加入200?L相同浓度的待测样品稀释液或浓缩液。

　　2.2.3按照步骤2.1.2-2.1.6进行实验。