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DNA聚合酶的相关知识解读

发布日期: 2019-09-26
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   DNA聚合酶是细胞复制DNA的重要作用酶。随着分子克隆技术,测序技术,基因诊断技术的发展,DNA聚合酶在生物技术中的作用也越来越多,各种通过基因手段突变的DNA聚合酶广泛的应用在生物技术中。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、 引物、dNTP 等的情况下)及其相辅的活性。
DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和外切酶活性协同作用,可以使DNA链上的切口向前推进,即没有新的DNA合成,只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nick translation)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时,DNApoIⅠ能从切口开始合成新的DNA链,同时切除原来的旧链。这样,从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP,则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子,可以用作探针进行分子杂交实验。
酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后,可能使酶的构象发生变化,促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点,则不能与模板配对,无法改变酶的构象而被339;-539;外切酶活性位点所识别并切除之。
TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性,可将PCR双链产物的每一条链3-39;加入单核苷酸尾,故可使PCR产物具有3-39;突出的单A核苷酸尾;另一方面,在仅有dTTP存在时,它可将平端的质粒的3-39;端加入单T核苷酸尾,产生3-39;端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性,可实现PCR产物的T-A克隆法。
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