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大型质粒抽提试剂盒的操作方法

发布日期: 2017-11-23
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    大型质粒抽提试剂盒采用碱裂解法裂解细菌,再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料。、专一吸附DNA。大型质粒抽提试剂盒使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。
    1) 柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL,12,000rpm(~13400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 
    2) 将4.5ml过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000rpm(~13400×g)离心1min,尽量吸取上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 
    3) 向留有菌液的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
    4) 向离心管中加入250μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA,造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏,如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。 
    5) 向离心管加入350μl溶液P3(,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀12000rpm(~13400×g)离心10min,此时在离心管底部形成沉淀。注意:P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。 
    6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀,12000rpm(~13400×g)离心30-60s。倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。 
    7)可选步骤:向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD,12000rpm(~13400×g)离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中。 
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