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BCA蛋白定量试剂盒的使用方法和注意事项

发布日期: 2022-11-12
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   BCA蛋白定量试剂盒是根据目前世界上常用的两种蛋白浓度检测方法之一——BCA(bicinchoninicacid)法研制而成,实现了对蛋白质进行快速、稳定、灵敏的浓度测定。本试剂盒的原理是蛋白质分子中的肽键结构在碱性环境下能与Cu2+络合生成络合物,将Cu2+还原成Cu+,而BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合,形成稳定的有颜色的复合物,并在562nm处有光吸收峰值,该复合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比,可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。1h内即可完成蛋白质定量检测。本试剂盒含有牛血清白蛋白(BSA)溶液作为蛋白质标准溶液,测定范围为20-2000µg/ml。
 
  使用方法
 
  1.融化蛋白标准品,取适量蛋白标准品稀释至终浓度为0.5mg/mL。蛋白样品使用什么溶液溶解,标准品也应用什么溶液稀释,但是为了简便起见,也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,加标准品稀释液补足到20μL,相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
 
  2.根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。例如5mLBCA试剂A加100μLBCA试剂B,混匀,配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24h内稳定。
 
  3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中,也加稀释液到20μL。
 
  4.各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置20~30min。也可以室温放置2h,或60℃放置30min。
 
  5.测定A562吸光值,540~595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
 
  注意事项
 
  1.蛋白标准品配制后可立即使用,也可以-20℃长期保存。
 
  2.BCA法测定蛋白浓度时,颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低,适合在较高温度孵育或适当延长孵育时间以获得更好检测效果。
 
  3.因为延长孵育时间会引起吸光值的变化,所以在用紫外分光光度计检测时,应尽可能加快检测速度,以免先检后检产生系统误差。
 
  4.标准蛋白液的加量应当准确,如果加量不准确,会导致制作出来的标准曲线出现偏差,影响待测样品的浓度计算,所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置标准蛋白液,另一方面应使用精确度高的移液枪。