多孔细胞培养板(如6孔、12孔、24孔、96孔板等)是细胞生物学实验中常用的工具,广泛应用于细胞增殖、毒性测试、基因转染等研究。正确使用多孔细胞培养板对实验结果的准确性和可重复性至关重要。
1.实验前的准备
(1)选择合适的培养板
多孔细胞培养板有不同的孔数和规格,需根据实验需求选择:
-96孔板:适用于高通量筛选(如MTT、CCK-8检测)。
-24孔或12孔板:适用于中等规模实验(如细胞迁移、转染)。
-6孔板:适用于较大规模培养(如蛋白提取、RNA提取)。
(2)培养板的预处理
-无菌处理:新开封的培养板可直接使用,若重复使用需严格灭菌(如紫外线照射或酒精浸泡后烘干)。
-包被处理:某些贴壁细胞(如原代细胞、神经细胞)需提前用多聚赖氨酸、胶原或明胶包被,以增强细胞贴附。
(3)细胞准备
-选择处于对数生长期的健康细胞。
-用胰酶消化后,离心收集细胞,调整至适当密度(如1×10⁴~1×10⁵cells/mL,具体依细胞类型而定)。
2.细胞接种
(1)计算接种密度
不同孔板的接种体积参考:
-96孔板:每孔100-200μL(约5×10³~1×10⁴cells)。
-24孔板:每孔0.5-1mL(约1×10⁵cells)。
-6孔板:每孔2-3mL(约2×10⁵~5×10⁵cells)。
(2)均匀接种
-使用移液枪轻柔吹打细胞悬液,避免气泡。
-沿孔壁缓慢加入液体,防止细胞聚集在中央。
-接种后轻摇培养板,使细胞分布均匀。
(3)培养条件
-将培养板放入37℃、5%CO₂培养箱中。
-接种后静置2-4小时,待细胞贴壁后再移动培养板。
3.细胞增殖检测
(1)显微镜观察
每日用倒置显微镜观察细胞形态、贴壁情况及污染。
(2)细胞计数法
-使用台盼蓝染色法计数活细胞。
-或采用自动细胞计数仪进行定量分析。
(3)CCK-8或MTT法
-CCK-8法:向每孔加入10%CCK-8溶液,孵育1-4小时后测450nm吸光度。
-MTT法:加入MTT溶液(终浓度0.5mg/mL),孵育4小时,溶解甲瓒后测570nm吸光度。
(4)EdU/BrdU标记
通过DNA合成标记检测增殖细胞,结合荧光显微镜或流式细胞术分析。
4.实验注意事项
(1)避免污染
-所有操作需在超净台中进行。
-培养板开盖时间尽量缩短,避免细菌或真菌污染。
(2)边缘效应
-96孔板边缘孔液体蒸发较快,可能导致数据偏差,可用PBS或培养基填充外围孔以减少影响。
(3)细胞均匀性
-接种前充分混匀细胞悬液,避免细胞成团。
-培养板放入培养箱时保持水平,防止液体分布不均。
(4)数据重复性
-每组实验至少设3个复孔,提高数据可靠性。
-使用同一批次培养板,减少批次差异。
5.实验结束后的处理
-废弃的培养液和细胞需经消毒处理(如84浸泡或高压灭菌)。
-一次性培养板按生物废弃物处理,可重复使用的需清洗并灭菌。