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如何正确使用多孔细胞培养板进行细胞增殖实验

发布日期: 2025-04-11
浏览人气: 54
   多孔细胞培养板(如6孔、12孔、24孔、96孔板等)是细胞生物学实验中常用的工具,广泛应用于细胞增殖、毒性测试、基因转染等研究。正确使用多孔细胞培养板对实验结果的准确性和可重复性至关重要。
 
  1.实验前的准备
 
  (1)选择合适的培养板
 
  多孔细胞培养板有不同的孔数和规格,需根据实验需求选择:
 
  -96孔板:适用于高通量筛选(如MTT、CCK-8检测)。
 
  -24孔或12孔板:适用于中等规模实验(如细胞迁移、转染)。
 
  -6孔板:适用于较大规模培养(如蛋白提取、RNA提取)。
 
  (2)培养板的预处理
 
  -无菌处理:新开封的培养板可直接使用,若重复使用需严格灭菌(如紫外线照射或酒精浸泡后烘干)。
 
  -包被处理:某些贴壁细胞(如原代细胞、神经细胞)需提前用多聚赖氨酸、胶原或明胶包被,以增强细胞贴附。
 
  (3)细胞准备
 
  -选择处于对数生长期的健康细胞。
 
  -用胰酶消化后,离心收集细胞,调整至适当密度(如1×10⁴~1×10⁵cells/mL,具体依细胞类型而定)。
 
  2.细胞接种
 
  (1)计算接种密度
 
  不同孔板的接种体积参考:
 
  -96孔板:每孔100-200μL(约5×10³~1×10⁴cells)。
 
  -24孔板:每孔0.5-1mL(约1×10⁵cells)。
 
  -6孔板:每孔2-3mL(约2×10⁵~5×10⁵cells)。
 
  (2)均匀接种
 
  -使用移液枪轻柔吹打细胞悬液,避免气泡。
 
  -沿孔壁缓慢加入液体,防止细胞聚集在中央。
 
  -接种后轻摇培养板,使细胞分布均匀。
 
  (3)培养条件
 
  -将培养板放入37℃、5%CO₂培养箱中。
 
  -接种后静置2-4小时,待细胞贴壁后再移动培养板。
 
  3.细胞增殖检测
 
  (1)显微镜观察
 
  每日用倒置显微镜观察细胞形态、贴壁情况及污染。
 
  (2)细胞计数法
 
  -使用台盼蓝染色法计数活细胞。
 
  -或采用自动细胞计数仪进行定量分析。
 
  (3)CCK-8或MTT法
 
  -CCK-8法:向每孔加入10%CCK-8溶液,孵育1-4小时后测450nm吸光度。
 
  -MTT法:加入MTT溶液(终浓度0.5mg/mL),孵育4小时,溶解甲瓒后测570nm吸光度。
 
  (4)EdU/BrdU标记
 
  通过DNA合成标记检测增殖细胞,结合荧光显微镜或流式细胞术分析。
 
  4.实验注意事项
 
  (1)避免污染
 
  -所有操作需在超净台中进行。
 
  -培养板开盖时间尽量缩短,避免细菌或真菌污染。
 
  (2)边缘效应
 
  -96孔板边缘孔液体蒸发较快,可能导致数据偏差,可用PBS或培养基填充外围孔以减少影响。
 
  (3)细胞均匀性
 
  -接种前充分混匀细胞悬液,避免细胞成团。
 
  -培养板放入培养箱时保持水平,防止液体分布不均。
 
  (4)数据重复性
 
  -每组实验至少设3个复孔,提高数据可靠性。
 
  -使用同一批次培养板,减少批次差异。
 
  5.实验结束后的处理
 
  -废弃的培养液和细胞需经消毒处理(如84浸泡或高压灭菌)。
 
  -一次性培养板按生物废弃物处理,可重复使用的需清洗并灭菌。
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