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cDNA文库构建的注意事项和操作

发布日期: 2023-02-20
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   cDNA文库构建是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
 
  一、SuperscriptII—RT合成第一链
 
  1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中加入xulmRNA(大约500ng)、1ulXhoIPrimer(1.4ug/ul)、
 
  (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-xulRNase-freewater)
 
  说明:大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
 
  2.混匀后,70℃反应10分钟。
 
  3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min。
 
  4.稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
 
  (1)4ul5×firststrandbuffer
 
  (2)2ul0.1MDTT
 
  (3)1ul10mMdNTP(自己配制)
 
  cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。