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cDNA文库构建的实验操作步骤

发布日期: 2021-10-15
浏览人气: 71
   cDNA文库构建在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细Chemicalbook胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。
  
  cDNA文库构建可以:
  (1)用于分离全长基因进而开展基因功能研究;
  (2)筛选目的基因并直接用于表达;
  (3)提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。
  
  RNA的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定)Chemicalbook,要构建一个高质量的cDNA文库,获得高质量的mRNA是至关重要的,所以处理mRNA样品时必须仔细小心。
  
  实验操作步骤:
  1.酚-氯仿对细胞裂解液进行处理,加入结合有polyT的磁珠加入,再吸出磁珠并且洗脱留下mRNA。
  2.琼脂糖凝胶电泳检测mRNA是否被裂解。
  3.cDNA第一条链的合成:使用polyT作为引物,逆转录酶催化第一条链的合成。
  4.cDNA第二条链的合成(引物合成法)
  4.1.使用末端转移酶向mRNA-cDNA杂合双链3撇端加入polyC
  4.2.NaOH水解mRNA,纯化cDNA的第一条链
  4.3.加入polyG作为引物。合成cDNA的第二条链
  4.4.纯化cDNA,使用单链特异性核酸酶对cDNA末端进行处理,形成平末端
  5.cDNA同载体连接:选择使用λ噬菌体载体,使用限制性核酸内切酶对载体和cDNA进行处理,后使用DNA连接酶将二者连接起来。
  6.体外包装并转化进入受体细胞。
  7.蓝白斑筛选cDNA文库。