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腺病毒包装服务前我们需要了解的问题

发布日期: 2020-05-13
浏览人气: 1489
   腺病毒是一种线性双链DNA病毒,具有宿主范围广,可感染分裂和非分裂细胞,制备滴度高、装载外源基因容量大等优点,被广泛用于生物医学基础研究和临床试验中,成为目前常用的基因治疗载体之一。腺病毒载体基于血清型5,删除了E1及E3基因,克隆质粒可以用来表达单基因的转基因表达,也可用来在双启动子或插入的IRES片段控制下的GFP报道的瞬时表达,以进行转染效率的分析。四环素诱导载体也可作为控制基因表达的载体。我们在进行腺病毒包装服务前一定要了解相关的问题:
  1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求?
  有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体,比如AdMax的KitC、KitD等,其总包装的外源片断要求小于8kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体,比如KitA、KitB等,外源片断要求小于5kb。注意,外源片断指包括启动子、外源基因和polyA等在内的整个插入片断。
  2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体?
  腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分,不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验,完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.
  3、如何提高腺病毒的活性?
  提高腺病毒的活性,关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程,如果扩增的病毒滴度高,那么纯化后就会更高的。
  4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTRs(未翻译区)的额外的碱基会影响蛋白表达吗?
  UTRs尽可能短一些,特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG前面可以加一小段(6-9bp)的碱基序列可以增强目的基因的表达,比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
  5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞?
  参照文献报道是简单的办法,也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
  Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞(包括分裂和非分裂细胞),比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞,比如乳腺癌、白血病细胞等,感染效率较低。
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