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关于双荧光素酶报告系统的那些百问百答

发布日期: 2019-12-24
浏览人气: 782
   双荧光素酶报告系统是该试剂盒先对转染后的细胞进行裂解,然后以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶的活性,之后在淬灭该荧光反应的同时,以腔肠素为底物检测海肾荧光素酶报告基因的活性;具有检测信号强、线性范围广、无内源活性干扰等特点。
  1:双荧光素酶报告基因适反应温度?
  A:室温(20-22℃)。反应时各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温。此两种荧光素酶的反应速率是受温度影响的,为了保证实验的一致性,我们推荐此两种工作液在检测时都孵育至室温。
  2:双荧光素酶报告基因载体该如何选择?
  A:1)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4或者自己构建的载体
  2)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4载体或者自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子(如SV40、CMV),而选用中等强度的启动子(如TK)。
  3:检测的荧光数值很低怎么办?
  A:检测的荧光数值很低说明细胞裂解液中的荧光素酶含量很低。通常解决办法为
  1)转染的质粒采用细胞转染级别的质粒抽提试剂盒抽提。
  2)优化转染条件,尽可能的提高转染效率。
  3)增加实验的细胞量,并且裂解细胞时,适当减少细胞裂解液的量。
  4:进行检测的过程中,荧光信号值太高该如何进行调整?
  A:1)在转染实验后,减少细胞的孵育时间。
  2)降低荧光信号采集时间。
  3)进行样品的稀释。
  5:萤火虫荧光素酶读值和海肾荧光素酶读值的比例多少时比较合适?
  A:尽量保证对照组的萤火虫荧光素酶的读值和海肾荧光素酶的读值接近,或者海肾荧光素酶的读值比萤火虫荧光素酶的读值稍高。对于具体的实验过程中,由于萤火虫荧光素酶质粒和海肾荧光素酶的质粒抽提的质量不一致,待检测目的调控元件的调控能力的不同等原因,一次实验很难达到一个比较好的实验结果,因此对于此实验,我们推荐预实验优化萤火虫荧光素酶质粒和海肾荧光素酶质粒的共转染量。
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