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磷酸化蛋白检测试剂盒采用酶标仪法的具体步骤

发布日期: 2017-10-14
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    磷酸化蛋白检测试剂盒首先用热碱将磷酸化蛋白中的磷酸基团水解下来,再通过染料分子与游离的磷酸分子结合,形成染料-磷酸复合物。本试剂盒具有操作简单快速、定量范围大、线性好和实验方案灵活等特点。
   1.选取18个酶标孔,分为标准组和样品组,依次分别标号1-7,8-9,均设置重复管号。样品实验前可做适当稀释或浓缩,样品可取2个不同浓度梯度。标号为8-9。标准组各管分别加入50 μl各浓度的磷酸化标准蛋白溶液;样品组分别加入50μl磷酸化蛋白样品。 
    2.各管加入50 μl 2.0 mol/L NaOH,混匀。 65℃水浴,保温30 min。 
    3.待溶液冷却至室温后,各管加入50 μl  4.7 mol/L HCl,混匀。 
    4.各管加入50 μl检测液,混匀。室温静置30 min,期间混匀1-2次,进行吸光度值检测前再混匀1次。
    5.以0号管作为空白对照,在分光光度计上测各管的A620值。 
    6.以标准组各管A620平均值为纵坐标,对应的磷酸化标准蛋白终浓度为横坐标,在酶标仪上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线,由样品管各管A620平均值计算样品中磷酸化蛋白的浓度。 
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